01、培養基的實驗室制備

    培養基的實驗室制備正確制備培養基是微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分，尤其是含有有毒物質(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規范和生產廠商提供的使用說明。培養基的不正確制備會導致培養基出現質量問題。

    使用商品化脫水合成培養基制備培養基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關數據，如質量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。
    使用各別成分制備培養基時,應按照配方準確配制,記錄所有細節信息,如;培養基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質含量、制造商、批號、pH、培養基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便溯源。

1.水除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。
微生物污染應不超過10³CFU/mL，最好低于10²CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。
2.稱量和復水稱量所需量的脫水培養基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質的培養基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養基結塊)后再加水至所需的量。
3.溶解和分裝脫水培養基加水后適當加熱,并不斷攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。
4.pH的測定和調整用pH計測定pH,必要時在滅菌前調節pH，除特殊說明外,培養基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌后調節pH，溶液需滅菌。注:商品化培養基在高壓滅菌前后pH可能發生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調節pH。
5.分裝將配置好的培養基分裝到適當的容器中，容器的體積至少為體積的1.2倍。
6.滅菌①概述培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。有些培養基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感，應在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關標準或生產廠商的使用說明）。
②濕熱滅菌濕熱滅菌在高壓鍋或培養基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說明的規定進行。注：大容量培養基（＞1000mL）滅菌時可能會造成過度加熱。
加熱后應采取適當的方式冷卻，防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基（如含亮綠的培養基）是非常重要的。
③過濾滅菌過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。一些濾膜上附著蛋白質或其他物質(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。
④監測應對經濕熱或過濾滅菌的培養基進行監測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監測。
7.添加劑的制備制備含有有毒物質(特別是抗生素）時應小心操作，避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發生其他不良反應。采用適當的預防措施并小心按照產品使用說明操作。不要使用過期的試劑；抗生素工作溶液現配現用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料，也可由使用者自行測定。

02培養基的使用

1.瓊脂培養基的融化
      將培養基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經過高壓滅菌的培養基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min），以免玻璃容器發生破裂。
      融化后的培養基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內培養基應盡快使用，放置時間一般不超過4h。剩余的培養基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養基，應根據相關標準，縮短融化后放置的時間。
      將瓊脂培養基倒入類似檢測培養使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。
      加入樣品的培養基應將溫度調節到44℃~47℃，或按照相關標準調節溫度。
2.培養基的脫氣必要時，在使用前將養基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子；加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。
3.添加成分的加入對熱不穩定的添加成分應在培養基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養基并充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。
4.培養基的棄置所有污染和未使用的培養基的棄置應采用安全的方式,并符合相關法律法規的規定。 

03平板的制備和儲存

傾注融化后的培養基到平皿中,使之在平皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直徑90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養基),或根據相關標準要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使之冷卻凝固。如果平板要儲存、培養時間超過48h或培養溫度超過40℃，要增加培養基的傾注量。
注：在培養過程中,瓊脂培養基會損失水分,在某些環境條件下會影響微生物的生長。,造成培養基水分損失的因素很多,如培養基的成分、平皿中培養基的量、培養箱的類型(如使用帶風扇的培養箱)、培養箱里的空氣濕度、平皿在培養箱中放置的位置和數量以及培養溫度等。
       凝固后的培養基應立即使用或存放在防止其成分發生變化的條件下,如存放于暗處和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側面做好標記,標記的內容包括培養基名稱、制備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養基編碼系統進行標記。
       將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產生,平板應冷卻后再裝入密封袋中。貯存前不要對培養基表面進行干燥處理。
       對于采用表面接種的固體培養基,應先對瓊脂表面進行干燥：揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養箱中(溫度設置為25℃~50℃)；或放在有對流風的無菌凈化臺中,直到培養基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業化的平板脂培養基應按照廠商提供的說明使用。

疑難解答

1.培養基不能凝固  
       ①培養基制備過程中過度加熱

②低pH值造成培養基酸解

③瓊脂使用量不正確

④瓊脂未完全溶解

⑤培養基成分未充分混勻

2. pH值不正確

①培養基制備過程中過度加熱

②水質不佳

③外部化學物質污染

④在不正確溫度下測量pH值

⑤pH計未正確校準

⑥脫水培養基質量差

3. 顏色異常

①培養基制備過程中過度加熱

②水質不佳

③脫水培養基質量差

④pH值不正確

⑤外來污染

4. 產生沉淀

①培養基制備過程中過度加熱

②水質不佳

③脫水培養基質量差

④pH值未正確控制

⑤如果是個別成分制備的培養基---原材料不純

5. 培養基出現抑制/生長率低

①培養基制備過程中過度加熱

②水質不佳

③脫水培養基質量差

④配方使用不對

⑤添加成分不正確，如加入添加成分時培養基過熱或添加濃度錯誤

⑥添加物被污染

6. 污染

①滅菌不充分

②無菌操作有誤

③添加物被污染

本文摘自《食品伙伴網》